一、實(shí)驗(yàn)原理

JC-1染料會(huì)根據(jù)線粒體膜電位變化呈現(xiàn)不同熒光特性：

• ?正常線粒體?：膜電位高時(shí)，JC-1形成J-聚集體，發(fā)射紅色熒光(Ex/Em=585/590nm)

• ?受損線粒體?：膜電位降低時(shí)，JC-1以單體形式存在，發(fā)射綠色熒光(Ex/Em=514/529nm)

• 紅/綠熒光強(qiáng)度比可定量反映膜電位變化

二、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

1. 主要試劑

• JC-1染料(常用濃度1-5mg/DMSO儲(chǔ)存液)

• 無血清培養(yǎng)基或JC-1染色緩沖液

• CCCP(50mM)作為陽性對(duì)照

• PBS緩沖液

2. 儀器設(shè)備

• 熒光顯微鏡/共聚焦顯微鏡

• 流式細(xì)胞儀(可選)

• CO?培養(yǎng)箱

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 工作液配制

• 將JC-1儲(chǔ)存液用DMSO稀釋至2.5-10μg/ml工作濃度

• 或用染色緩沖液稀釋(如50μL JC-1+8mL PBS+2mL 5×緩沖液)

2. 細(xì)胞處理

?貼壁細(xì)胞?：

1. 培養(yǎng)至80-90%匯合度

2. 棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2-3次

3. 加入JC-1工作液(六孔板1ml/孔)

4. 37℃孵育15-30分鐘

?懸浮細(xì)胞?：

1. 離心收集細(xì)胞(300g,5min)

2. 重懸于培養(yǎng)基(10? cells/ml)

3. 加入JC-1工作液(0.5ml/50-100萬細(xì)胞)

3. 洗滌與檢測(cè)

1. 孵育后用預(yù)冷PBS或染色緩沖液洗滌2-3次

2. 貼壁細(xì)胞可消化后收集

3. 熒光顯微鏡觀察或流式檢測(cè)

四、結(jié)果分析

1. 熒光觀察

• ?健康細(xì)胞?：線粒體呈紅色熒光聚集

• ?凋亡細(xì)胞?：綠色熒光擴(kuò)散至胞質(zhì)

• 典型結(jié)果示例：CCCP處理的陽性對(duì)照幾乎全部細(xì)胞顯示綠色熒光

2. 數(shù)據(jù)分析

• 流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅/綠熒光強(qiáng)度比

• 計(jì)算膜電位變化率：紅綠比降低代表去極化

五、注意事項(xiàng)

1. ?染料處理?：

• 避免反復(fù)凍融，建議分裝保存

• 低溫會(huì)凝固，需20-25℃水浴溶解

• 稀釋后立即使用，防止聚集

2. ?實(shí)驗(yàn)控制?：

• 設(shè)置未染色對(duì)照和CCCP陽性對(duì)照(通常50μM,5min)

• 不同細(xì)胞類型需優(yōu)化CCCP濃度和作用時(shí)間

3. ?圖像獲取?：

• 共聚焦顯微鏡建議488nm激發(fā)，530nm(綠)/590nm(紅)雙通道采集

• 避免長(zhǎng)時(shí)間光照導(dǎo)致熒光淬滅